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蘋果中酵母菌的分離

更新時(shí)間:2018-10-09  |  點(diǎn)擊率:2537

喆圖小編今天來說說酵母菌,酵母菌是一些單細(xì)胞真菌,并非系統(tǒng)演化分類的單元。酵母菌是人類文明史中被應(yīng)用得早的微生物
大多數(shù)酵母菌的菌落特征與細(xì)菌相似,但比細(xì)菌菌落大而厚,菌落表面光滑、濕潤、粘稠,容易挑起,菌落質(zhì)地均勻,正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一,菌落多為乳白色,少數(shù)為紅色,個(gè)別為黑色。未發(fā)現(xiàn)其有性階段的酵母菌稱假酵母。
大多數(shù)酵母菌為腐生,其生活適pH為4.5-6,常見于含糖分較高的環(huán)境中,例如果園土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生長迅速,易于分離培養(yǎng),在液體培養(yǎng)基中,酵母菌比霉菌生長得快。 
利用酵母菌喜歡酸性環(huán)境的特點(diǎn),常用酸性液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得酵母菌的培養(yǎng)液(這樣做的好處是酸性培養(yǎng)條件則可抑制細(xì)菌的生長),然后在固體培養(yǎng)基上劃線分離之。
  酵母菌細(xì)胞的死活可用美藍(lán)進(jìn)行區(qū)別。原因是美藍(lán)為弱氧化劑,無毒,且還原后變?yōu)闊o色。如果是活的酵母細(xì)胞,由于新陳代謝不斷進(jìn)行,細(xì)胞內(nèi)氧化還原電勢頗低,還原力強(qiáng),若有美藍(lán)染料進(jìn)入活的酵母細(xì)胞內(nèi),即被還原成無色,而死的細(xì)胞或代謝緩慢的衰老,由于它們無還原能力或還原能力弱,仍可被美藍(lán)染成藍(lán)色或淺藍(lán)色。 
將少量酵母菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中,在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng),定時(shí)測定培養(yǎng)液中的菌量,以菌量的對數(shù)作縱坐標(biāo),生長時(shí)間作橫坐標(biāo),繪制的曲線叫生長曲線,它反映了單細(xì)胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)的群體生長規(guī)律。依據(jù)其生長速率的不同,一般可把生長曲線分為延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。這四個(gè)時(shí)期的長短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所改變。因此通過測定微生物的生長曲線,可了解各菌的生長規(guī)律,對于科研和生產(chǎn)都具有很重要的指導(dǎo)意義。
實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)基制備 
1,蘋果、梨等、0.1%美藍(lán)染液、1ml的吸管、無菌培養(yǎng)皿、試管、高壓鍋、恒溫培振蕩養(yǎng)箱等。
2,馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基); 
原料:馬鈴薯(80g)、葡萄糖(8g)、瓊脂(4g)、蒸餾水(400ml)。 
配制方法: 
(1) 先將馬鈴薯去皮,切片,稱80克并加蒸餾水400ml,煮沸半小時(shí), 用紗布過濾,補(bǔ)足蒸餾水量至400ml,制成20%的馬鈴薯汁。 
(2) 在200ml20%的馬鈴薯汁中加入4g瓊脂,4g葡萄糖,煮沸熔化, 補(bǔ)足水分并在115℃條件下高壓滅菌20分鐘。制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板。 
3,豆芽汁液體培養(yǎng)基:稱取黃豆芽50g,加水100ml,煮沸1h,過濾后 補(bǔ)足水分,121℃濕熱滅菌后存放備用,此即為50%的豆芽汁。取50%豆芽汁200ml,葡萄糖50g,水800ml,自然pH,在115℃條件下高壓滅菌20min。 
4,YPD培養(yǎng)基:配方:1%酵母膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖。 配制方法(1000ml配方):溶解10g酵母膏,20g蛋白胨于900ml水中, 121℃20min高壓滅菌。同時(shí)將20g葡萄糖加入100ml水中,121℃20min高壓滅菌。然后在超凈臺中兩者混合。
 注:葡萄溶液和酵母膏、蛋白胨溶液混合后在高溫下可能會發(fā)生化學(xué)反 應(yīng),導(dǎo)致培養(yǎng)成分變化,所以要分別滅菌后在混合,但要注意無菌操作。
 實(shí)驗(yàn)步驟      
1、接種:取一小塊果皮,不需沖洗,直接接入豆芽汁液體培養(yǎng)基試管 中,置28-30℃,培養(yǎng)24h,可見培養(yǎng)液變渾濁。
2、培養(yǎng),用無菌吸管取上述培養(yǎng)后培養(yǎng)液0.1ml,注入另一管豆芽汁 液體培養(yǎng)基中,置28-30℃再培養(yǎng)24h或稍長(過長則霉菌長出)。
3、觀察:用無菌操作法取少許菌液置于載玻片中央的0.1%美藍(lán)染液中, 混勻后加蓋玻片制成水浸片,先用低倍鏡后換用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽生殖情況。  活酵母可使美藍(lán)還原,從而使菌體不著色,用此方法可判斷酵母菌的死 活。 
4、分離:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基溶化后制成平板。用劃線法分離酵 母培養(yǎng)液,從而得到單個(gè)菌落。 
5、生長曲線測定:挑取單個(gè)菌落接種于30mlYPD液體培養(yǎng)基中,30℃、 180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24h,取擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液的菌液按照1:100的接種量接種于3瓶50mlYPD培養(yǎng)液中,同樣條件下振蕩培養(yǎng),并分別于培養(yǎng)后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30h取菌種培養(yǎng)懸液5ml,以未接種的酵母YPD液體培養(yǎng)基校正7200型紫外可見分光光度計(jì)的零點(diǎn),在波長600nm處比色測定菌液OD600值。以各時(shí)間點(diǎn)菌液的吸光光度值(OD600)為縱坐標(biāo),以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制出酵母工程的生長曲線。
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